系統(tǒng)性硬化癥（SSc）患者通常表現(xiàn)為皮膚纖維化，也可延伸至內(nèi)臟器官。纖維化是由于細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白（如纖連蛋白和膠原蛋白）的過(guò)度沉積，主要由活化的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)破壞、器官功能障礙及器官衰竭。漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞（pDCs）是先天免疫細(xì)胞，專(zhuān)門(mén)產(chǎn)生大量 I 型干擾素（IFN），這與 SSc 有關(guān)。事實(shí)上，pDCs 在 SSc 患者的受累組織中積累，研究表明，小鼠模型中 pDCs 的消耗可改善纖維化。此外，激活的 pDCs 通過(guò)持續(xù)產(chǎn)生 IFN-α 導(dǎo)致 SSc 中 I 型 IFN 水平的升高。

不同的生理?xiàng)l件，特別是當(dāng)對(duì)蛋白質(zhì)合成和折疊有很高的需求時(shí)，可能會(huì)促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激。在未折疊和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)積累后，免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白（BiP）與 ER 應(yīng)激傳感器——蛋白激酶R 樣ER 激酶（PERK）、肌醇需求酶1（IRE1）和激活轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）——解離，未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）被啟動(dòng)以支持 ER 穩(wěn)態(tài)。枯草桿菌酶細(xì)胞毒素 SubAB 是一種由產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（STEC）菌株產(chǎn)生的 AB5 毒素，通過(guò)裂解 BiP 誘導(dǎo) ER 應(yīng)激。用藥物誘導(dǎo)劑促進(jìn)人肺成纖維細(xì)胞的 ER 應(yīng)激可上調(diào)膠原蛋白和成纖維細(xì)胞活化標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的產(chǎn)生。

據(jù)報(bào)道，ER 應(yīng)激標(biāo)志物在 SSc 中上調(diào)，重要的是，在 SSc 患者分離的循環(huán) pDCs 中觀察到 ER 應(yīng)激信號(hào)通路失調(diào)。盡管最近的研究將 pDCs、ER 應(yīng)激和 SSc 聯(lián)系起來(lái)，但它們?cè)诶w維化中作用的確切機(jī)制仍不清楚。鑒于 pDCs 和成纖維細(xì)胞可能在受影響的組織中相互作用，因此，葡萄牙阿威羅大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究所及澳大利亞阿德萊德大學(xué)分子與生物醫(yī)學(xué)系研究團(tuán)隊(duì)探討了 ER 應(yīng)激對(duì) pDCs 和成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)的影響。研究成果發(fā)表于 Cell Communication and Signaling 期刊題為“Promoting ER stress in a plasmacytoid dendritic cell line drives fibroblast activation”。

首先，為了研究 pDCs 對(duì)成纖維細(xì)胞行為的影響，建立了 CAL-1 細(xì)胞、pDC 細(xì)胞系和 IMR-90 肺成纖維細(xì)胞的體外共培養(yǎng)模型，觀察到 CAL-1 細(xì)胞與成纖維細(xì)胞形成偶聯(lián)物，經(jīng)過(guò)幾個(gè)洗滌步驟后不易脫落（圖1 A ）。當(dāng)比較共培養(yǎng)物與單獨(dú)培養(yǎng)的 IMR-90 和 CAL-1 細(xì)胞組合的對(duì)照中不同 ECM 成分的量時(shí)，觀察到 α-SMA 的蛋白質(zhì)和 mRNA 水平均降低，I 型膠原 mRNA 水平也有所降低，這可能是由于共培養(yǎng)中 CAL-1 和 IMR-90 細(xì)胞之間的生長(zhǎng)速率存在差異，從而可能會(huì)影響細(xì)胞：細(xì)胞比例，同時(shí)降低產(chǎn)生 α-SMA 的細(xì)胞比例。

為了測(cè)試 pDC 激活是否會(huì)影響成纖維細(xì)胞活化，將 IMR-90-CAL-1 與 Toll 樣受體7（TLR7）激動(dòng)劑 CL307 共培養(yǎng)，其促進(jìn) CAL-1 細(xì)胞分泌 IFN-β，結(jié)果觀察到，IMR-90 細(xì)胞單一培養(yǎng)和 IMR-90-CAL-1 細(xì)胞共培養(yǎng)在用 CL307 處理后均未表現(xiàn)出纖連蛋白或 α-SMA 表達(dá)的改變（圖1 B）。

為了測(cè)試 ER 應(yīng)激對(duì)共培養(yǎng)物的影響，用 SubAB 處理細(xì)胞。正如預(yù)期，SubAB 處理在單獨(dú)培養(yǎng)的 IMR90 細(xì)胞和 IMR-90-CAL-1 細(xì)胞共培養(yǎng)中誘導(dǎo)了 UPR 激活，GADD34 水平升高證實(shí)了這一點(diǎn)。GADD34 在激活的 ER 應(yīng)激傳感器 PERK 的下游產(chǎn)生，并作為負(fù)反饋蛋白，以減弱 UPR 信號(hào)傳導(dǎo)。SubAB 處理單獨(dú)培養(yǎng)的 IMR-90 成纖維細(xì)胞導(dǎo)致纖連蛋白水平增加，而不影響 α-SMA，并降低 I 型膠原 mRNA 水平。單獨(dú)培養(yǎng)的 CAL-1 細(xì)胞不表達(dá)纖連蛋白、α-SMA 和 I 型膠原蛋白。然而，最重要的是，將 SubAB 添加到 IMR-90-CAL-1 共培養(yǎng)物中促進(jìn)了纖連蛋白和 α-SMA 在蛋白質(zhì)和 mRNA 水平上的產(chǎn)生。

因此，SubAB 誘導(dǎo)的 ER 應(yīng)激與 CAL-1 細(xì)胞的存在相結(jié)合，促進(jìn)纖連蛋白的產(chǎn)生和成纖維細(xì)胞活化，這是纖維化的兩個(gè)標(biāo)志。

圖1 IMR-90 和 CAL-1 細(xì)胞在共培養(yǎng)中相互作用。

接下來(lái)，還測(cè)試了其他 ER 應(yīng)激誘導(dǎo)劑的作用，即抑制蛋白質(zhì)糖基化的衣霉素（Tm）和 BiP 抑制劑 HA15。出乎意料的是，Tm 處理在共培養(yǎng)和 IMR-90 單一培養(yǎng)中分別誘導(dǎo)了纖連蛋白和 α-SMA 蛋白水平的降低（圖2 A）。通過(guò)分析 Tm 處理 6 小時(shí)后 PERK 和 eIF2α 的磷酸化以及 GAD34 的上調(diào)證實(shí)了 IMR-90 和 CAL-1 細(xì)胞中的 ER 應(yīng)激誘導(dǎo)。另一方面，HA15 以更像 SubAB 的方式影響直接共培養(yǎng)，上調(diào)纖連蛋白和 α-SMA 蛋白水平（圖2 B）。然而，HA15 并未促進(jìn)纖連蛋白在單一培養(yǎng)的 IMR-90 細(xì)胞中的積累，盡管 GADD34 在孵育3 天后上調(diào)（圖2 B）。

之前已經(jīng)觀察到，pDC 暴露于 SubAB 會(huì)觸發(fā) PERK 和 IFN 基因刺激因子（STING）的激活，這是誘導(dǎo) pDC 激活的關(guān)鍵。因此，為了闡明 CAL-1 細(xì)胞 PERK 和 STING 表達(dá)的作用，直接將 IMR-90 與 Sting1−/− 或 Perk/EIF2AK3−/− CAL-1 細(xì)胞共培養(yǎng)（圖2 C ）。雖然 STING 的缺失不會(huì)影響纖連蛋白的表達(dá)，但 PERK 的缺失消除了 SubAB 處理的共培養(yǎng)物中纖連蛋白和 α-SMA 表達(dá)的上調(diào)（圖2 C）。

這些結(jié)果表明，在 CAL-1 細(xì)胞中，BiP 抑制/降解和隨之而來(lái)的 UPR 誘導(dǎo)，特別是 PERK 通路，促進(jìn)了 CAL-1 和 IMR-90 細(xì)胞共培養(yǎng)物中纖連蛋白和 α-SMA 的產(chǎn)生。

圖2 BiP 抑制/耗竭和 PERK 激活影響 IMR-90-CAL-1 共培養(yǎng)物中纖連蛋白和 α-SMA 的表達(dá)。

TGF-β1 是一種眾所周知的促纖維化因子，通過(guò)與 TGF-β 受體2 結(jié)合直接激活成纖維細(xì)胞，誘導(dǎo) ECM 的產(chǎn)生，還可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能。為了闡明 SubAB 誘導(dǎo)的作用是否伴隨著 TGF-β1 上調(diào)，分析了其在細(xì)胞培養(yǎng)基中的 mRNA 表達(dá)和蛋白質(zhì)水平，發(fā)現(xiàn) SubAB 沒(méi)有誘導(dǎo) TGF-β1 表達(dá)，但其分泌水平降低，這可能是由于 PERK 激活下游的蛋白質(zhì)合成抑制（圖3 B）。因此，SubAB 處理的共培養(yǎng)物中的成纖維細(xì)胞活化不受 TGF-β1 驅(qū)動(dòng)。

為了測(cè)試成纖維細(xì)胞活化是否可以由細(xì)胞分泌的其他因子介導(dǎo)，將 IMR-90 成纖維細(xì)胞與來(lái)自 CAL-1 或 IMR-90-CAL-1 共培養(yǎng)物的 CM 一起孵育（圖3 B）。結(jié)果觀察到，與各自的對(duì)照相比，用 SubAB 處理的來(lái)自 CAL-1 單獨(dú)培養(yǎng)或直接共培養(yǎng)物的 CM 都不會(huì)促進(jìn) IMR-90 細(xì)胞中纖連蛋白或 α-SMA 的產(chǎn)生增加（圖3 C、D）。此外，在存在或不存在 SubAB 的情況下，將 IMR-90 成纖維細(xì)胞在下室中共培養(yǎng)，CAL-1 細(xì)胞或 IMR-90-CAL-1 共培養(yǎng)物置于上室（圖3 E），發(fā)現(xiàn)這兩種條件都沒(méi)有導(dǎo)致 IMR-90 α-SMA 的產(chǎn)生增加（圖3 F、G）。在 SubAB 條件下觀察到纖連蛋白水平略有增加，這更可能是由于添加到培養(yǎng)物中的 SubAB 的影響，GADD34 的存在證實(shí)了這一點(diǎn)（圖3 C、F）。這些結(jié)果表明，SubAB 處理的 CAL-1 細(xì)胞分泌的可溶性因子，無(wú)論是在單一培養(yǎng)中還是與 IMR-90 成纖維細(xì)胞接觸共培養(yǎng)中，都不足以促進(jìn)成纖維細(xì)胞活化。

這些發(fā)現(xiàn)表明，ER 應(yīng)激導(dǎo)致 CAL-1 以細(xì)胞間接觸依賴(lài)性方式促進(jìn) IMR-90 成纖維細(xì)胞的激活。

圖3 在 SubAB 誘導(dǎo)的 ER 應(yīng)激期間，CAL-1 誘導(dǎo)的 IMR-90 激活依賴(lài)于細(xì)胞間接觸。

總體而言，該研究發(fā)現(xiàn)，ER 應(yīng)激激活的 CAL-1 細(xì)胞可以通過(guò)直接接觸成纖維細(xì)胞（纖維化的核心關(guān)鍵參與者之一）觸發(fā) ECM 產(chǎn)生和 IMR-90 成纖維細(xì)胞活化。因此，這項(xiàng)工作揭示了 pDCs 可能導(dǎo)致纖維化的機(jī)制，這有助于理解纖維化過(guò)程，并為纖維化疾病的創(chuàng)新方法的開(kāi)發(fā)開(kāi)辟新的前景，特別是對(duì)于 SSc。

參考文獻(xiàn)：Ferreira BH, Silva IS, Mendes A, Leite-Pinheiro F, Paton AW, Paton JC, Duarte IF, Pierre P, Almeida CR. Promoting ER stress in a plasmacytoid dendritic cell line drives fibroblast activation. Cell Commun Signal. 2025 Feb 7;23(1):66. doi: 10.1186/s12964-025-02057-7. PMID: 39920698; PMCID: PMC11804055.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39920698/

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