對(duì)于骨的形成和再生，提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)的充分的血管形成是必不可少的。改善骨組織工程應(yīng)用中血管形成的策略包括使用血管生成生長(zhǎng)因子、內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）和通過(guò)動(dòng)靜脈袢進(jìn)行手術(shù)誘導(dǎo)的血管生成。在許多研究中，ECs和間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的共培養(yǎng)已被證明有利于增殖和成骨分化。在臨床實(shí)踐方面，從骨髓中分離出的MSCs 在數(shù)量和供體發(fā)病率方面可能受到限制。而來(lái)自脂肪組織的干細(xì)胞是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的有趣替代品。

以往的研究描述了分離、表征和多重分化潛力，并且已經(jīng)表明脂肪來(lái)源的干細(xì)胞（ADSCs）也適用于動(dòng)物的骨缺損愈合。此外，ADSCs在免疫調(diào)節(jié)能力和促血管生成因子和細(xì)胞外基質(zhì)成分的分泌方面甚至優(yōu)于MSCs，特別是在與內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)中，ADSCs的成骨分化可以進(jìn)一步增加。此外，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）具有顯著的血管形成能力。ADSCs和HUVECs在組織工程應(yīng)用中的共同應(yīng)用似乎是增加血管形成和骨形成的有前途的方法。

基于此，德國(guó)埃爾朗根大學(xué)附屬醫(yī)院整形和手外科、輸血科的一項(xiàng)研究曾探索了二維細(xì)胞培養(yǎng)中HUVECs和成骨分化的ADSCs的最佳比例及其對(duì)增殖、細(xì)胞存活、成骨和血管生成的影響，為此，進(jìn)行了ADSCs和HUVECs的共培養(yǎng)，比例為25%：75%，50%：50%和75%：25%。通過(guò)陰性免疫選擇，實(shí)驗(yàn)試圖更詳細(xì)地揭示細(xì)胞類型對(duì)細(xì)胞凋亡，血管生成和成骨分化的特定影響。

細(xì)胞增殖

在第3、7和14天進(jìn)行WST-8檢測(cè)測(cè)定細(xì)胞增殖。結(jié)果表明，14天后，所有組的活細(xì)胞數(shù)量均增加（圖1）。7天后，含有 75% 或 25% ADSCs的共培養(yǎng)組中活細(xì)胞的數(shù)量增加。14天后，與單一培養(yǎng)相比，能夠證明所有共培養(yǎng)組中有更多的活細(xì)胞。

圖1 與單培養(yǎng)相比，共培養(yǎng)ADSCs和HUVECs在7天和14天后增殖能力增強(qiáng)。

細(xì)胞凋亡

與HUVEC比例成正比，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到ADSCs的凋亡率增加，其中75% ADSCs共培養(yǎng)組在7天和14天后的凋亡率最高（圖2 A）。相反，HUVECs在與ADSCs共培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)出單向減少的細(xì)胞凋亡。有趣的是，在ADSC比例≥50%的共培養(yǎng)中，細(xì)胞凋亡在第一周更明顯減少。2周后，無(wú)法檢測(cè)到ADSC比例對(duì) HUVECs 細(xì)胞凋亡的任何顯著影響（圖2 B）。為了闡明其潛在的機(jī)制，進(jìn)行了磷酸化-BAD蛋白（一種促凋亡蛋白）的ELISA，證實(shí)了磷酸化BAD的比例較低，這可能解釋了共培養(yǎng)ADSCs中較高的細(xì)胞凋亡率。另一方面，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)的HUVECs中磷酸化BAD水平的升高導(dǎo)致細(xì)胞凋亡減少（圖2 C、D）。

圖2 共培養(yǎng)ADSCs和HUVECs降低了HUVECs的細(xì)胞凋亡，而ADSCs的凋亡增加了（A，B）。在共培養(yǎng)時(shí)，在ADSCs和HUVECs中評(píng)估磷酸化的蛋白BAD的量，表明共培養(yǎng)的HUVECs中磷酸化BAD量較高（C，D）。

成骨分化

通過(guò)茜素紅測(cè)定證明，共培養(yǎng)ADSCs和HUVECs增加了基質(zhì)礦化。此外，共養(yǎng)組的基質(zhì)礦化度隨著HUVEC比例的提高而增加。堿性磷酸酶（ALP）活性是成骨分化的另一個(gè)替代參數(shù)。在第3天，觀察到具有 HUVECs ≥25% 的共培養(yǎng)組中ALP活性的誘導(dǎo)。7天后，這種效應(yīng)在所有共培養(yǎng)組中更加明顯。

在陰性免疫選擇和PCR之后，實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蜃C明ALP基因表達(dá)的誘導(dǎo)僅限于ADSCs。此外，實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)到50% ADSCs共培養(yǎng)組中ALP mRNA水平最高（圖3 A）。此外，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后ADSCs中成骨轉(zhuǎn)錄因子RUNX2的水平增加。與 50% ADSCs共培養(yǎng)時(shí)，RUNX2表達(dá)上調(diào)幅度最大（圖3 B）。

圖3 陰性免疫分離后ALP和RUNX2基因表達(dá)的PCR分析。在含有50% ADSCs的共培養(yǎng)組中，ALP的表達(dá)顯著增加（A）。在共培養(yǎng)的ADSCs中也觀察到了RUNX2表達(dá)較高的趨勢(shì)（B）。

血管生成

為了研究ADSC / HUVEC共培養(yǎng)的血管生成潛力，進(jìn)行了基質(zhì)膠成管實(shí)驗(yàn)。與成骨分化ADSCs相反，未分化的ADSCs在基質(zhì)膠中形成管狀。在共培養(yǎng)中，管的數(shù)量和長(zhǎng)度與HUVECs的數(shù)量成比例地增加（圖4 A‐H）。通過(guò)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的ELISA，能夠證明在單一培養(yǎng)條件下ADSCs在第3和第7天的VEGF產(chǎn)量最高。此外，在含有 ≥50% HUVECs的共培養(yǎng)中，VEGF的產(chǎn)生在第3天更加明顯。第7天共培養(yǎng)物之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖4 I）。內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）或基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP3）等血管生成分子的基因表達(dá)在共培養(yǎng)的HUVECs中隨著ADSCs比例的增加而增加。

此外，共培養(yǎng)刺激ADSCs中內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）、血管生成素2（Ang2）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1（VEGF R1）的基因表達(dá)，而MMP3基因表達(dá)下調(diào)。

圖4 基質(zhì)膠測(cè)定表明，管數(shù)（G）和總管長(zhǎng)（H）隨著HUVEC比例的增加而增加。除此之外，未分化的ADSCs（F）形成管狀。VEGF ELISA檢測(cè)顯示在單培養(yǎng)條件下ADSCs中VEGF產(chǎn)量最高。

總之，該研究結(jié)果表明，在ADSCs和HUVECs的共培養(yǎng)中，增殖、成骨分化和促血管生成特征顯著增強(qiáng)，特別是當(dāng)使用 50% ADSCs：50% HUVECs的細(xì)胞比例時(shí)。此外，HUVECs的細(xì)胞凋亡單向降低，這是由磷酸化-BAD依賴性機(jī)制介導(dǎo)的。在骨組織工程方面，有必要進(jìn)行進(jìn)一步的體內(nèi)研究來(lái)研究這些有前景的體外效應(yīng)。

參考文獻(xiàn)：Mutschall H, Winkler S, Weisbach V, Arkudas A, Horch RE, Steiner D. Bone tissue engineering using adipose-derived stem cells and endothelial cells: Effects of the cell ratio. J Cell Mol Med. 2020 Jun;24(12):7034-7043. doi: 10.1111/jcmm.15374. Epub 2020 May 12. PMID: 32394620; PMCID: PMC7299704.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32394620/

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