正畸牙齒移動(dòng)（OTM）是一個(gè)機(jī)械力誘導(dǎo)牙周組織改建的過程。壓力側(cè)的牙槽骨吸收和張力側(cè)新骨再生的平衡決定了 OTM 的速度。一氧化氮（NO）已被證明對(duì)骨代謝有影響。NO 供體對(duì)成骨細(xì)胞的生長和骨形成具有有益的影響。同時(shí)，它們會(huì)降低破骨細(xì)胞的活性。研究指出，牙周組織在正畸力的作用下產(chǎn)生 NO。NO 的前體（L-精氨酸）加速了大鼠的 OTM，增加了壓力側(cè)破骨細(xì)胞的數(shù)量和Howship腔隙，而抑制 NO 產(chǎn)生的 NOS（一氧化氮合酶）抑制劑會(huì)減少 OTM。因此，NO 也對(duì) OTM 產(chǎn)生了重大影響。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了三種 NOS 亞型：神經(jīng)元型（nNOS）、內(nèi)皮細(xì)胞型（eNOS）和誘導(dǎo)型（iNOS）。已經(jīng)證明，eNOS 介導(dǎo)張力側(cè)的骨形成，而 iNOS 介導(dǎo)壓力側(cè)的骨吸收。eNOS 和 iNOS 似乎是 OTM 過程中骨重塑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它們主要分布在骨細(xì)胞中。與骨細(xì)胞不同，牙周膜細(xì)胞在早期 OTM 階段更傾向于成為機(jī)械傳感器，與 NO 信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）是間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），對(duì)維持牙周組織的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。先前的證據(jù)表明，hPDLSCs 參與 OTM 過程。循環(huán)拉伸力（CTF）促進(jìn) hPDLSCs 中成骨基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)，如堿性磷酸酶、RUNX2、osterix 蛋白和骨橋蛋白。此外，機(jī)械應(yīng)變可以刺激 hPDLSCs 分化成成骨細(xì)胞。

在首都醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔正畸學(xué)教研室及全牙再生與口腔組織功能重建實(shí)驗(yàn)室小組的一項(xiàng)研究中報(bào)道了 hPDLSCs 可以產(chǎn)生 NO，NO 具有促進(jìn) PDLSCs 成骨分化的能力。在這項(xiàng)研究中，重點(diǎn)研究了模擬 OTM 的過程的機(jī)械拉伸力對(duì) hPDLSCs 產(chǎn)生 NO 變化的影響，還發(fā)現(xiàn)了骨代謝的變化以及這一過程中涉及的潛在信號(hào)通路。

正畸力誘導(dǎo)體內(nèi) NO 產(chǎn)生和 NOS 表達(dá)

為了研究體內(nèi) OTM 過程中 NO 的產(chǎn)生，使用小鼠正畸力（30g）模型進(jìn)行研究（圖1 a）。施加力7天后，OTM 的 HE 和顯微 CT 分析顯示，第一磨牙向內(nèi)側(cè)移動(dòng)。觀察到遠(yuǎn)端牙周膜變寬，而近中端牙周膜受壓（圖1 b-d）。與對(duì)照組相比，NO2- 濃度在施加正畸力的小鼠血清中升高（圖1 e）。

圖1 正畸力誘導(dǎo)NO產(chǎn)生和NOS表達(dá)。

力誘導(dǎo)的 NO 調(diào)節(jié) OTM 過程和骨形成

為研究力誘導(dǎo)的 NO 產(chǎn)生對(duì) OTM 過程的影響，注射 NOS 抑制劑 L-NMMA 抑制其生成，并注射 NO 前體 L-精氨酸以增加 OTM 過程中的內(nèi)源性 NO 生成（圖1 f-g）。施加力7天后，測量上頜第一磨牙和第二磨牙之間的距離。與對(duì)照組相比，L-NMMA 對(duì) NOS 的抑制作用縮短了 OTM 的距離。同時(shí)，注射L-精氨酸上調(diào)了 NO 水平并增加 OTM 的距離。

免疫組織化學(xué)染色顯示，與 PBS 對(duì)照組相比，在 OTM 期間阻斷內(nèi)源性 NO 的產(chǎn)生可抑制張力側(cè)牙周膜和牙槽骨中堿性磷酸酶陽性 hPDLSCs 和骨細(xì)胞的積累（圖2 a、b、d）。為了進(jìn)一步確認(rèn) NO 在 OTM 中的功能，注射了 L-精氨酸以提高小鼠的 NO 水平。結(jié)果顯示，與 PBS 對(duì)照組相比，張力側(cè)牙周膜和牙槽骨中堿性磷酸酶陽性 hPDLSCs 和骨細(xì)胞的積累增加（圖2 a、c、d）。

圖2 在OTM期間，力誘導(dǎo)的NO可以調(diào)節(jié)張力側(cè)的骨形成活動(dòng)。
（a-c）遠(yuǎn)端張力側(cè)的代表性免疫組織化學(xué)圖像。（b、d）L-NMMA注射顯著抑制牙周膜堿性表達(dá)，促進(jìn)堿性磷酸酶的表達(dá)。

循環(huán)拉伸力在體外誘導(dǎo) NO 生成和 NOS 表達(dá)

接下來，實(shí)驗(yàn)研究了 hPDLSCs 的 NO 產(chǎn)生，這在 OTM 的骨形成過程中非常重要。此外，通過免疫染色評(píng)估發(fā)現(xiàn)人 hPDLSCs 表達(dá) eNOS 和 iNOS。為了研究 NO 產(chǎn)生的機(jī)制，對(duì) hPDLSCs 施加循環(huán)拉伸力（10%伸長率，0.5 Hz，6、12、24 h），以在體外探索機(jī)械力對(duì) NO 產(chǎn)生的影響。已經(jīng)證明，hPDLSCs 在沒有力刺激的情況下產(chǎn)生 NO。檢測 hPDLSCs 的培養(yǎng)上清液中 NO2- 的濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在12小時(shí)和24小時(shí)后顯著增加（圖3 a）。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，eNOS 和 iNOS 蛋白表達(dá)上調(diào)，qPCR 結(jié)果顯示相同的趨勢(shì)（圖3 b、c）。這些數(shù)據(jù)表明，施加 CTF 在 hPDLSCs 中促進(jìn) NO 生成，這可能對(duì)生物學(xué)功能產(chǎn)生影響。

圖3 循環(huán)拉力誘導(dǎo)NO產(chǎn)生和NOS表達(dá)來調(diào)節(jié)hPDLSC的成骨。

力誘導(dǎo)的 NO 可能會(huì)調(diào)節(jié) OTM 期間張力側(cè)的骨形成

實(shí)驗(yàn)假設(shè) OTM 期間張力側(cè)的骨形成可能是力誘導(dǎo)的 NO 通過 hPDLSCs 的成骨分化調(diào)控的。先前的研究表明，循環(huán)拉伸力促進(jìn)了 hPDLSCs 的成骨分化。實(shí)驗(yàn)用 CTF 處理 hPDLSCs 持續(xù)0小時(shí)，6小時(shí)，12小時(shí)和24小時(shí)，qPCR 檢測到 RUNX2，Osterix 和骨橋蛋白 mRNA 水平升高（圖3 d）。RUNX2 的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示出相同的趨勢(shì)（圖3 e）。

為了研究不同濃度的 NO 對(duì)成骨的影響，用 L-NMMA 處理 hPDLSCs 以降低 NO2- 的濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在體外循環(huán)拉伸力下，外源 NO 供體硝普鈉（SNP）增加 NO2- 的濃度（圖3 f）。qPCR 結(jié)果顯示，在 CTF 期間 NO 產(chǎn)生受到抑制時(shí)，RUNX2、Osterix 和骨橋蛋白 mRNA 表達(dá)降低，而在 CTF 期間促進(jìn) NO 生成時(shí)，它們的表達(dá)增加（圖3 g）。RUNX2 的蛋白質(zhì)印跡顯示出相同的趨勢(shì)（圖3 h）。

hPDLSCs 中的力誘導(dǎo)的 NO 可能調(diào)控 PI3K/Akt 信號(hào)通路

為了研究力誘導(dǎo)的 NO 如何影響 hPDLSCs 的成骨，實(shí)驗(yàn)分析了 NO 下游通路 PI3K/Akt。刺激 hPDLSCs 后，p-PI3K、p-Akt 和活性 β-連環(huán)蛋白的表達(dá)水平上調(diào)（圖4 a）。然后，用 PI3K 抑制劑 LY294002 處理 hPDLSCs，發(fā)現(xiàn) p-PI3K、p-Akt 和活性 β-連環(huán)蛋白的表達(dá)水平下調(diào)（圖4 b）。此外，用 NO 抑制劑 L-NMMA 處理 hPDLSCs，發(fā)現(xiàn) L-NMMA 抑制了 CTF 處理下 hPDLSCs 中 PI3K/Akt 通路的促進(jìn)（圖4 c）。

圖4 PDLSCs中力誘導(dǎo)NO可以通過PI3K / Akt信號(hào)通路由iNOS調(diào)節(jié)。

由于 NO 在 OTM 中的功能作用尚未完全闡明，該研究證明，力誘導(dǎo)的內(nèi)源性 NO 促進(jìn) PDLSCs 的成骨活性，有助于維持 OTM 期間牙槽骨的穩(wěn)態(tài)。NO 是調(diào)節(jié) OTM 過程所必需的，NO 水平的降低導(dǎo)致 OTM 距離縮短。隨著對(duì) NO 在 OTM 中的作用的認(rèn)識(shí)的加深，可能會(huì)帶來一種基于 NO 供體的 OTM 的加速治療方法。

參考文獻(xiàn)：Sun Y, Fu J, Lin F, Li S, Du J, Liu Y, Bai Y. Force-Induced Nitric Oxide Promotes Osteogenic Activity during Orthodontic Tooth Movement in Mice. Stem Cells Int. 2022 Sep 6;2022:4775445. doi: 10.1155/2022/4775445. PMID: 36110889; PMCID: PMC9470363.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36110889/

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